Konsep Dasar Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction)

A.   Pengertian teknik PCR

Polymerase chain reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase merupakan suatu teknik perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Teknik ini banyak dilakukan di bidang biokimia, bidang kedokteran/medis dan biologi molekuler sebab cukup praktis dan murah, hanya memerlukan sampel yang sedikit, dan dapat dihasilkan DNA dalam jumlah besar dengan waktu singkat, sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada (tahun 1983). Suatu penemuan di bidang genetika yang luar biasa.

B.   Komponen dalam penggunaan teknik PCR

Berbagai komponen dalam Polymerase chain reaction (PCR) yaitu:

e DNA Template (cetakan), yaitu DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen yang akan digandakan.

e DNA Polimerase, yaitu enzim yang mengkatalisis polimerisasi nukleotida menjadi untaian DNA.

e Oligonukleotida Primer, yaitu DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA.

e dNTP (deoxynucleoside triphosphate), sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru, terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.

e Buffer, yaitu bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan DNA polymerase.

e Ion Logam, sebagai kofaktor DNA polymerase, tanpa ion ini DNA polymerase tidak dapat bekerja. Umumnya ion bivalen (Mg²⁺) dan monovalen (K⁺).

C.   Tahapan Reaksi

PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:

1.   Denaturasi, yaitu pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal melalui pemanasan pada temperatur 94-96 °C selama 30-60 detik.

2.   Annealing atau Penempelan, yaitu hibridisasi antara oligonukleotida primer dengan utas tunggal cetakan DNA pada suhu 45-60 °C.

3.   Ekstensi/elongasi, yaitu pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim DNA polymerase pada suhu 70-72^oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya.

Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:

e Pra-denaturasi, dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polimerase.

e Final Elongasi, dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72^oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir.

D.  Peranan dan Fungsi PCR

Teknik Polymerase Chain Reaction berperan untuk :

1.    Amplifikasi urutan nukleotida.

2.    Menentukan kondisi urutan nukleotida yang mengalami mutasi.

3.    Bidang kedokteran forensik.

4.    Melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan finger print.

E.   Aplikasi teknik PCR

Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya :

ù  Isolasi Gen, untuk mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genom manusia dan menyisipkannya ke sel bakteri, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.

ù  DNA Sequencing, urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR menggunakan satu primer dengan tambahan dideoxynucleotide.

ù  Forensik, jika proses identifikasi korban secara fisik sulit dilakukan, maka dilakukan pengujian DNA dengan mengambil sampel dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarga yang memiliki pertalian darah.

ù  Diagnosa Penyakit,  PCR merupakan teknik yang sering digunakan untuk diagnosa penyakit berbahaya seperti Influenza A(H₁N₁).

  

Sumber Referensi Pendukung:

Karcher, Susan J. 1995. Molecular Biology A Project Approach. Academic Press. USA.